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Scientific Reports 13권, 기사 번호: 11652(2023) 이 기사 인용

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측정항목 세부정보

CRISPR 게놈 편집은 생물학적 기능을 설명하는 강력한 도구입니다. 의도한 대로 게놈을 수정하려면 발생할 수 있는 다양한 재조합 방식을 이해하는 것이 필수적입니다. 본 연구에서는 MMEJ(Microhomology-medium End Joining)를 사용하여 CRISPR 편집을 통해 조건부 대립 유전자를 생성하는 동안 식별된 복잡한 벡터 삽입을 보고합니다. 표적화 벡터에는 2개의 loxP 서열과 측면에 있는 40bp 마이크로상동성이 포함되어 있습니다. loxP 서열에 해당하는 게놈 영역은 마우스 배아 줄기 세포에서 Cas9로 절단되었습니다. 표적화된 재조합에 대한 PCR 스크리닝에서는 예상보다 더 큰 크기의 밴드가 높은 빈도로 나타나는 것으로 나타났습니다. 이들 밴드의 나노기공 시퀀싱은 MMEJ뿐만 아니라 비-상동성 말단 연결 및 클론의 적어도 17%에서 상동성 재조합에 의해 매개되는 복잡한 벡터 삽입을 밝혀냈습니다. PCR 조건을 개선하자 새로운 밴드가 나타났는데, 이는 표준 PCR 스크리닝을 벗어나는 의도하지 않게 변형된 대립유전자가 존재함을 시사합니다. 이로 인해 우리는 이형접합성 단일 뉴클레오티드 다형성을 사용하여 게놈 편집 클론의 각 대립유전자의 재조합을 특성화하여 동형접합 대립유전자의 존재를 확인하게 되었습니다. 우리의 연구는 복잡하고 의도하지 않은 표적 내 벡터 삽입을 배제하기 위해 게놈 편집 클론의 세심한 품질 관리가 필요하다는 것을 나타냅니다.

최근에는 CRISPR 시스템1의 등장으로 게놈 변형 기술이 크게 발전했습니다. 그러나 CRISPR 게놈 편집에서는 의도하지 않은 재조합이 항상 발생할 수 있습니다. 따라서, 클론에서 의도한 재조합이 의도하지 않은 재조합을 동반하지 않도록 하기 위해서는 게놈 편집 클론의 품질 관리가 중요합니다. 의도하지 않은 재조합은 재조합 표적 부위 또는 표적 부위로부터 멀리 떨어진 게놈 영역에서 발생할 수 있습니다. 후자 유형의 재조합은 가이드 RNA(gRNA)의 부분 어닐링으로 인해 표적 서열과 유사한 게놈 서열에서 종종 발생합니다. 이러한 재조합을 "표적 외" 효과라고 하며 이를 검출하기 위한 다양한 방법이 개발되었습니다2,3. 이전의 의도하지 않은 "표적 내" 재조합과 관련하여 대상 사이트 전체에서 대규모 삭제가 보고되었습니다4,5,6,7. 일반적으로 관심 있는 재조합체는 PCR로 스크리닝됩니다. 따라서 PCR 프라이머 결합 부위의 손실을 수반하는 대규모 게놈 삭제가 눈에 띄지 않을 수 있습니다. 최근에는 gRNA 벡터나 미토콘드리아 DNA가 표적 게놈 절단 부위에 삽입되는 다른 유형의 의도하지 않은 표적 재조합이 보고되었습니다8. 이러한 경우 PCR 프라이머 결합 부위는 보존되었지만, PCR 앰플리콘 크기가 검출 한계를 초과했기 때문에 초기 PCR 스크리닝에서는 의도하지 않은 외인성 서열의 삽입이 눈에 띄지 않게 되었습니다. 이러한 의도하지 않은 표적 내 재조합은 특히 이대립유전자 게놈 편집이 의도된 경우 주의 깊게 조사되어야 합니다. PCR 분석으로 확인된 야생형(wt) 대립유전자의 손실은 동형접합 게놈 편집이 아니라 의도된 유전자 조합에 의해 발생할 수 있기 때문입니다. 한 대립 유전자의 재조합과 다른 대립 유전자의 의도하지 않은 재조합.

본 연구에서는 배양된 세포에서 Cre/loxP 시스템에 대한 조건부 대립유전자를 생성하는 과정에서 식별한 의도하지 않은 복잡한 표적 내 벡터 삽입 패턴에 대해 보고합니다. 조건부 대립유전자를 생성하려면 두 개의 loxP 서열을 삽입해야 합니다. 하나는 표적 게놈 영역의 업스트림이고 다른 하나는 다운스트림입니다. 또한, 배양된 세포에서 표현형 분석을 수행하려면 두 대립유전자 모두 동일한 방식으로 수정되어야 합니다. 따라서 총 4개의 loxP 사이트가 게놈에 삽입되어야 합니다. 상동성 재조합(HR), 비상동성 말단 결합(NHEJ) 및 미세상동성 매개 말단 결합(MMEJ)과 같은 다양한 복구 경로를 사용하여 외래 서열을 게놈에 도입할 수 있습니다. HR은 가장 널리 사용되는 경로이며 표적화 벡터9에서 500-1000bp의 상동성 부분이 필요합니다. HR 경로는 주로 세포주기의 S단계부터 G2 단계까지 활성화되는 것으로 보고되었습니다. 대조적으로, NHEJ 경로는 세포 주기 전반에 걸쳐 활성화됩니다. 따라서 NHEJ 기반 방법은 HR11에 비해 재조합 부위의 접합 서열을 제어하기 어렵지만 뉴런과 같이 HR 방법이 비효율적인 세포 유형에 표적 삽입을 허용합니다. 최근에는 MMEJ를 사용하는 PITCh(Precise Integration into Target Chromosome) 시스템이라는 방법이 개발되었습니다12,13. 이 방법은 재조합을 위해 길이가 10-40개 염기만큼 짧은 미세상동성 암을 활용합니다. MMEJ 경로는 주로 M단계에서 초기 S단계까지 활성화되는 것으로 보고되어 HR과 비교하여 다른 재조합 모드를 허용합니다. 우리는 본 연구에서 PITCh 방법을 사용했는데, 그 이유는 34-염기 loxP 서열이 게놈에 삽입되는 것이 표적화 벡터의 상동성 암(homology arm)의 길이가 짧기 때문에 PCR에 의해 쉽게 검출될 수 있기 때문이다. 그러나 PCR 스크리닝 결과 고주파수에서 예상보다 긴 의도하지 않은 크기의 밴드가 밝혀졌습니다. Nanopore 긴 판독 시퀀싱을 사용하여 이러한 밴드를 분석하면 MMEJ뿐만 아니라 HR 및 NHEJ도 포함하는 복잡한 벡터 삽입이 밝혀졌습니다. 삽입된 벡터 서열의 크기는 게놈 편집 클론에 대한 표준 PCR 기반 품질 관리 방법의 검출 한계를 초과할 수 있습니다. 우리는 본 연구에서 검출된 의도하지 않은 표적 내 재조합이 게놈 편집의 품질 관리 단계에서 신중하게 제외될 필요가 있다고 제안합니다.