단일 라이브러리 준비를 위한 매우 효율적인 계획

Scientific Reports 13권, 기사 번호: 13913(2023) 이 기사 인용

389 액세스

3 알트메트릭

측정항목 세부정보

이중 가닥 DNA로부터 라이브러리 준비 시퀀싱 방법은 잘 확립되어 있지만 단일 가닥 DNA(ssDNA)의 방법은 잘 연구되지 않았습니다. 또한, 기존 방법은 효율성과 수율에 한계가 있습니다. 따라서 우리는 ssDNA로부터 라이브러리 준비를 시퀀싱하기 위한 매우 효율적인 절차를 개발했습니다. 이 방법에서, ssDNA의 첫 번째 어댑터 태깅은 최근 보고된 TdT(terminal deoxyribonucleotidyl transferase) 보조 아데닐레이트 커넥터 매개 ssDNA(TACS) 결찰을 사용하여 수행됩니다. 어댑터 태그가 지정된 ssDNA를 사용하여 상보적인 가닥 합성 후 백시니아 바이러스 토포이소머라제 I(VTopoI 또는 TOPO) 기반 어댑터 ​​결찰을 통한 두 번째 어댑터 태깅이 수행됩니다. 제안된 TACS-TOPO 체계는 어댑터 이합체의 분해, 억제 및 제거를 위한 추가 단계를 통해 24pg의 ssDNA 샘플에서 어댑터 이합체가 없는 시퀀싱 라이브러리 준비를 실현합니다. TACS-TOPO 체계는 50μL의 인간 혈청에서 증폭 없는 라이브러리 준비를 통해 무세포 DNA 분석에 성공적으로 적용되었습니다. 수정된 TACS-TOPO 체계는 고대 인간 뼈에서 추출한 DNA에도 적용되어 기존 라이브러리 준비 프로토콜을 사용하는 것보다 2~8배 더 많은 라이브러리 수율을 가져왔습니다. 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 어댑터를 사용하여 VTopoI 및 그 복합체를 준비하는 절차도 설명되어 있습니다. 전반적으로, 제안된 TACS-TOPO 체계는 ssDNA의 실용적이고 민감한 서열 분석을 용이하게 할 수 있습니다.

이중 가닥 DNA(dsDNA)1,2,3로부터 라이브러리 준비를 시퀀싱하는 데 많은 효율적인 방법을 사용할 수 있지만 단일 가닥 DNA(ssDNA)에 대해서는 제한된 방법이 보고됩니다. 현재까지 ssDNA로부터 라이브러리 준비 시퀀싱을 위한 세 가지 주요 원칙만 확립되었습니다. 첫 번째 접근법은 ssDNA의 3'말단에 대한 TdT(terminal deoxyribonucleotidyl transferase) 매개 동종중합체 테일링을 포함합니다. 그런 다음 꼬리는 표적 ssDNA를 dsDNA로 변환하기 위한 프라이밍 사이트로 사용되며, 두 번째 어댑터는 T4 DNA 리가제4로 태깅됩니다. TdT 매개 라이브러리 준비는 매우 효율적이며 일부 제조업체에서는 이 원리에 따라 라이브러리 준비 키트를 제공합니다. 그러나 긴 꼬리는 다운스트림 시퀀싱 분석에 장애물이 될 수 있습니다.

두 번째 방법은 5'-인산화된 어댑터를 ssDNA의 3'-말단에 연결하는 RNA 리가제에 의해 촉매되는 ssDNA 연결을 기반으로 합니다. 예를 들어, Meyer 그룹은 CircLigase II5,6을 기반으로 한 방법을 확립했습니다. Adapter ligation 후 ssDNA는 dsDNA로 변환되고 이어서 T4 DNA ligase에 의한 두 번째 어댑터 태깅이 이어집니다. RNA 리가아제는 두 개의 ssDNA 분자를 연결할 수 있지만 반응 효율은 몇 퍼센트 미만으로 제한됩니다. 따라서 RNA 리가제를 사용한 라이브러리 준비의 수율은 다소 제한적입니다.

세 번째 접근법은 ssDNA 결찰을 위해 T4 DNA 리가제를 사용합니다7. 이 방법에서는 한쪽 끝에 단일 가닥 랜덤 헥사머가 있는 이중 가닥 어댑터가 사용됩니다. 무작위 헥사머가 표적 ssDNA의 끝 부분에 호환 가능하게 혼성화되면 어댑터의 부분적으로 이중 가닥 끝 부분의 틈을 T4 DNA 리가제로 밀봉할 수 있습니다. 이 splinted ligation 기반 절차를 ssDNA2.0이라고 하며 CircLigase II 기반 방법7보다 우수한 효율성을 보여줍니다. RNA 리가제 기반 방법과 T4 DNA 리가제 기반 방법 모두 표적 ssDNA와의 깔끔한 연결을 생성할 수 있지만 라이브러리 준비 시 효율성이 낮다는 점은 아직 해결되지 않았습니다.

ssDNA로부터 서열 라이브러리 준비를 개선하기 위해 우리는 TdT(terminal deoxyribonucleotidyl transferase) 보조 아데닐레이트 커넥터 매개 단일 가닥(ss) DNA(TACS) 결찰이라고 불리는 ssDNA의 효율적인 어댑터 태깅을 위한 기술을 개발했습니다8. TACS 결찰에서 표적 ssDNA는 먼저 리보테일링이라는 과정에서 TdT를 사용하여 몇 가지 아데닐산염으로 꼬리를 붙인 다음, 리보테일 ssDNA의 RNA 리가제 매개 어댑터 태깅이 이어집니다. ssDNA의 3'-말단을 리보테일링하면 RNA처럼 행동할 수 있으며, 이는 RNA 리가제의 ssDNA 결찰 효율을 크게 향상시킵니다. 따라서, TACS 결찰은 표적 ssDNA8의 3'-말단의 80% 이상에 대한 어댑터-태깅을 허용합니다. 특히, TdT와 리보뉴클레오티드의 테일링 반응은 1-3개의 뉴클레오티드를 확장한 후에 자동으로 억제되어 다운스트림 시퀀싱 분석이 최소한으로 중단됩니다.